ABSTRACT
This paper investigated the effect of cryoprotectant substances on Prochilodus lineatus embryos in an experimental incubator. The prospective study applied combinations of polyvinyl alcohol, hydroxyethyl cellulose, gelatin and fetal bovine serum with dimethyl sulfoxide and ethylene glycol in a new experimental incubator. The morphology of embryos, larval viability and the efficiency of experimental incubators in maintaining the quality of embryos were evaluated. This study demonstrates the efficient association between hydroxyethylcellulose and dimethyl sulfoxide as greater viability (p<0.05) was found for embryos (72.9 ± 23.9%). It should also be noted the permeation of cryoprotectants in embryos through the changes found in chorion diameter, embryo diameter and embryo volume comparing the treatments versus control group (water) (p<0.05), this results can help in future cryopreservation protocols. Although the temperature and oxygenation differed between the usual and experimental incubators (p<0.05), the results showed a high fertilization rate (79.6 ± 13.2%) for experimental incubators (p<0.05) which is sufficient for the maintenance of embryos in a cryoprotective environment and effectively allows experimentation for long periods with cryoprotectant substances. Cryopreservation of fish embryos has not been accomplished yet and new approaches are required for understanding the permeability of teleost embryos, especially in Brazilian native species.
Este trabalho avaliou o efeito de substâncias crioprotetoras sobre embriões de Prochilodus lineatus em uma incubadora experimental. O estudo aplicou combinações de álcool polivinílico, hidroxietilcelulose, gelatina e soro fetal bovino com dimetilosulfóxido e etilenoglicol em uma nova incubadora experimental. Foram avaliadas a morfologia dos embriões, a viabilidade larval e a eficiência das incubadoras experimentais na manutenção da qualidade dos embriões. Este estudo demonstra a associação eficiente entre hidroxietilcelulose e dimetilsulfóxido pela maior viabilidade (p<0,05) encontrada para os embriões (72,9 ± 23,9%). Deve-se notar também a permeação dos crioprotetores nos embriões através das alterações encontradas no diâmetro córion, diâmetro do embrião e no volume do embrião comparando os tratamentos ao grupo controle (água) (p<0,05), estes resultados podem ajudar em futuros protocolos de criopreservação. Embora a temperatura e a oxigenação diferiram entre as incubadoras comuns e as experimentais (p<0,05), os resultados mostraram elevada taxa de fertilização (79,6 ± 13,2%) para incubadoras experimentais (p<0,05), o que é suficiente para a manutenção de embriões em ambiente crioprotetor e permite efetivamente a experimentação por longos períodos com substâncias crioprotetoras. A criopreservação de embriões de peixes ainda não foi realizada e novas abordagens são necessárias para a compreensão da permeabilidade dos embriões de teleósteos, especialmente em espécies nativas brasileiras.
Subject(s)
Animals , Characiformes/embryology , Cryoprotective Agents/toxicity , Incubators/veterinary , Embryo, Nonmammalian/physiologyABSTRACT
This study investigated the addition of antioxidants vitamin E and reduced glutathione on curimba (Prochilodus lineatus) semen cryopreservation and compared sodium bicarbonate solution and distilled water as activators. The experiment was conducted at the environmental station of CEMIG, in Itutinga-MG, Brazil, between December/2009 and January/2010. Semen samples (n = 7) with semen motility above 80% were diluted in cryoprotectant solutions composed of 10% methanol, 15% lactose and containing different concentrations of antioxidants: 50 (VE50), 100 (VE100) and 250 (VE250) µM of vitamin E, and 0.5 (RG0.5), 1.0 (RG1.0) and 1.5 (RG1.5) mM of reduced glutathione. A solution without antioxidants was used as a control. The semen was diluted at a ratio of 1:4 (100 ìL semen:400 ∝L cryoprotectant solution). The toxicity of the solutions was evaluated by investigating semen motility after 10 min in the solution. The rest of the diluted semen was placed into 0.5 mL straws maintained in nitrogen vapour for 24 hours and packed into a nitrogen liquid cylinder for four days. The samples were thawed in a water bath at 60°C for 8 s and the rate (%) and duration (s) of semen activation with distilled water or sodium bicarbonate was evaluated. In the toxicity test, we found that vitamin E and reduced glutathione were not toxic to curimba semen at any of the tested concentrations (P>0.05). The duration of motility was longer (P<0.05) in semen activated with sodium bicarbonate 1% (163 ± 11 s), which was considered the best activator for semen under these conditions. No significant differences were found between the cryoprotectant solutions used after freezing (P>0.05). Thus, the antioxidants vitamin E and reduced glutathione did not improve the quality of cryopreserved curimba semen, but they did not cause toxic effects to the semen in natura and they did not decrease its quality during cryopreservation.
Este estudo avaliou a adição de antioxidantes vitamina E e glutationa reduzida no sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus) e comparou solução de bicarbonato de sódio e água destilada como ativadores. O experimento foi conduzido na estação ambiental da CEMIG, em Itutinga-MG, entre Dezembro/2009 e Janeiro/2010. Sêmen de sete animais, com motilidade espermática acima de 80%, foi diluído em soluções crioprotetoras compostas por metanol 10% e lactose 15% em diferentes concentrações de antioxidantes: 50 (VE50), 100 (VE100) e 250 (VE250) µM de vitamina E, 0,5 (RG5.5), 1,0 (RG1.0) e 1,5 (RG1.5) mM glutationa reduzida e uma solução controle sem antioxidante. O sêmen foi diluído na proporção de 1:4 (100 µL de sêmen: 400 µL de solução crioprotetora). A toxicidade das soluções foi avaliada pela motilidade espermática após de 10 minutos em solução. O restante do sêmen diluído foi armazenado em palhetas de 0,5 mL mantidos em vapor de nitrogênio por 24 horas e estocado em cilindro de nitrogênio líquido por quatro dias. As amostras foram descongeladas em banho-maria a 60°C por 8 segundos e avaliada a taxa (%) e duração (s) pela ativação do sêmen com água destilada e bicarbonato de sódio a 1%. No teste de toxicidade, observamos que os antioxidantes da vitamina E e glutationa, nas diferentes concentrações, não foram tóxicos para o sêmen do curimba (P>0,05). A duração da motilidade foi maior (P<0,05) no sêmen ativado com bicarbonato de sódio, sendo o melhor ativador para o sêmen nestas condições. Não houve diferenças significativas entre as soluções crioprotetoras utilizadas para sêmen antes e após congelamento (P>0,05). Assim, os antioxidantes vitamina E e glutationa reduzida não melhoram a qualidade do sêmen criopreservado de curimba, mas não causam efeitos tóxicos para o sêmen in natura e criopreservados por não diminuir sua qualidade durante a criopreservação.